Prevention of Clostridium difficile infection in hamsters using a non-toxigenic strain / Prevenção da infecção por Clostridium difficile em hamsters usando uma estirpe não toxigênica

ABSTRACT: The present study aimed to evaluate five non-toxigenic strains of Clostridium difficile (NTCD) in vitro and to select one strain to prevent C. difficile (CDI) infection in hamsters (Mesocricetus auratus). The NTCD strains were evaluated for spore production in vitro, antimicrobial susceptibility and presence of antimicrobial resistance genes. Approximately 107 spores of the selected strain (Z31) were administered by esophageal gavage in hamsters pretreated with 30mg kg-1 of clindamycin. The challenge with a toxigenic strain of C. difficile was conducted at 36 and 72h, and the animals were observed for 28 days. The NTCD strain of C. difficile (Z31) was able to prevent CDI in all animals that received it.

RESUMO: O presente trabalho objetivou a avaliação in vitro de cinco estirpes não toxigênicas de Clostridium difficile (NTCD) e seleção de uma delas para prevenção de infecção por C. difficile (CDI) em hamsters (Mesocricetus auratus). As estirpes NTCD foram avaliadas quanto à produção de esporos in vitro, sensibilidade antimicrobiana e presença de genes de resistência a antimicrobianos. Aproximadamente 107 esporos da estirpe selecionada (Z31) foram administrados por gavagem esofágica em hamsters previamente tratados com 30mg kg-1 de clindamicina. O desafio com uma estirpe toxigênica de C. difficile ocorreu nos tempos experimentais 36 e 72h, e os animais foram observados por 28 dias. A estirpe NTCD de C. difficile (Z31) foi capaz de prevenir a CDI em todos os animais que a receberam.

Jejunal hemorrhage syndrome in a Zebu cow in Brazil / Síndrome de jejuno hemorrágico em gado Zebu no Brasil

Clostridium perfringens type A has been incriminated as the etiologic agent in jejunal hemorrhage syndrome (JHS), which is a disease that affects dairy cattle. Although this microorganism is considered an important enteropathogen the pathogenesis of JHS is still not clear, and there have been no reports of its occurrence in Brazil so far. The aim of this study was to describe the occurrence of JHS by infection with a C. perfringens type A strain carrying the beta-2 toxin gene in a zebu cow in Brazil, for the first time.

Clostridium perfringens tipo A tem sido considerado agente etiológico da síndrome do jejuno hemorrágico (SJH), que é uma doença que afeta comumente os rebanhos de gado. Embora este microrganismo seja considerado um importante enteropatógeno, a patogênese da SJH ainda não foi elucidada, e não havia sido reportada no Brasil até então. O alvo deste estudo foi descrever pela primeira vez a ocorrência da SJH causada por C. perfringens tipo A, carreador do gene da toxina beta-2, em um zebuíno no Brasil.

Histopathological, immunohistochemical and biomolecular diagnosis of myocarditis due to Clostridium chauvoei in a bovine / Diagnóstico anatomopatológico, imuno-histoquímico e biomolecular de um caso de miocardite por Clostridium chauvoei em um bovino

The aim of this study was to report a case of clostridial myocarditis in a bovine in Brazil with emphasis on the pathological findings, isolation and molecular identification associated with the in situ localization of C. chauvoei. The animal, a male Brangus bull with nine months of age, was found dead without prior clinical signs. Multifocal and coalescent areas of necrosis were observed in the myocardium. Rod cells in the cardiac muscle fibers were positive immunostaining for C. chauvoei, while this bacterium was also isolated and identified by polymerase chain reaction (PCR).

O objetivo deste estudo foi relatar um caso de miocardite clostridial em um bovino no Brasil, com ênfase nos achados patológicos, isolamento e identificação molecular do agente e visualização in situ de C. chauvoei. O animal, um macho da raça Brangus com nove meses de idade, foi encontrado morto sem sinais clínicos prévios. Foram observadas áreas de necrose multifocal e coalescente no miocárdio, com a presença de bastonetes imunomarcados para C. chauvoei nas fibras musculares cardíacas. Uma estirpe de C. chauvoei foi isolada do tecido e sua identidade foi confirmada por reação em cadeia da polimeras (PCR).

Padronização de um modelo de infecção por Clostridium difficile em hamsters sírios Mesocricetus auratus / Standardization of a model of Clostridium difficile infection in syrian hamsters Mesocricetus auratus

O objetivo do presente trabalho foi padronizar um modelo de infecção por Clostridium difficile (ICD) em hamsters sírios (Mesocricetus auratus). Para seleção dos isolados capazes de causar letalidade, cinco animais por grupo receberam uma dose de clindamicina (30mg kg-1) por gavagem. Após 48 horas, administraram-se 107 unidades formadoras de colônia (UFC), por animal, de quatro diferentes isolados toxigênicos de C. difficile. Selecinou-se um dos isolados capazes de causar diarreia e letalidade e administrou-se 4x102; 4x104; 4x106; 4x108UFC por animal, novamente com cinco hamsters por grupo. Em todas as diluições testadas, foi possível observar a ocorrência de diarreia e morte. A maior concentração testada (4x108UFC por animal) causou óbito de 100% dos hamsters do grupo. Todos os animais que vieram a óbito apresentaram tiflite hemorrágica, foram positivos para as toxinas A/B e foi possível isolar C. difficile do conteúdo intestinal, confirmando a reprodução experimental da doença. A dose letal para 50% da população foi estabelecida em 6,3x104UFC por animal. O modelo de indução de ICD em hamsters descritos no presente estudo passa a ser uma ferramenta valiosa para estudos relativos à patogenia, tratamento e controle dessa doença.

The aim of this study was to standardize a model of Clostridium difficile infection (CDI) in Syrian hamsters (Mesocricetus auratus). In order to evaluate strains capable of causing lethality, five hamsters per group received clindamycin (30mg kg-1) by gavage. After 48 hours, 107 colony forming units (CFU) of spores' solution of four strains were administered per animal. One strain capable of causing diarrhea and death was selected and administered at the following concentrations: 4x102; 4x104; 4x106; 4x108 CFU per animal. All dilutions tested were able to cause diarrhea and death. The highest concentration showed 100% of mortality. Post mortem evaluation revealed hemorrhagic typhlitis in all death animals. In addition, all intestinal contents were positive for A/B toxins, and toxigenic C. difficile strains were isolated, confirming the induction of infection by this microorganism. The dose lethal to 50% of the population was calculated: 6.3x104 CFU per animal. The standardized model of CDI in hamster is now available for studies on pathogenesis, treatment and control of this disease.

Detection of toxins A/B and isolation of Clostridium difficile and Clostridium perfringens from dogs in Minas Gerais, Brazil

The objective of this study was to detect C. difficileA/B toxins and to isolate strains of C. perfringensand C. difficile from diarrheic and non-diarrheic dogs in Brazil. Stool samples were collected from 57 dogs, 35 of which were apparently healthy, and 22 of which were diarrheic. C. difficileA/B toxins were detected by ELISA, and C. perfringensand C. difficilewere identified by multiplex PCR. C. difficileA/B toxins were detected in 21 samples (36.8%). Of these, 16 (76.2%) were from diarrheic dogs, and five (23.8%) were from non-diarrheic dogs. Twelve C. difficile strains (21.1%) were isolated, of which ten were A+B+and two were A-B-. All non-toxigenic strains were isolated from non-diarrheic animals. The binary toxin gene cdtBwas found in one strain, which was A+B+and was derived from a non-diarrheic dog. C. perfringensstrains were isolated from 40 samples (70.2%). Of these, 18 (45%) were from the diarrheic group, and 22 (55%) belonged to the non-diarrheic group. All isolates were classified as C. perfringenstype A and there was an association between the detection of the cpegene and the presence of diarrhea. Interestingly, ten strains (25%) were positive for the presence of the cpb2gene. The high rate of detection of the A/B toxins in non-diarrheic dogs suggests the occurrence of subclinical disease in dogs or carriage of its toxins without disease. More studies are needed to elucidate the epidemiology of C. difficileand C. perfringensin dogs and to better our understanding of C. difficileas a zoonotic agent. This is the first study to report the binary toxin gene in C. difficilestrains isolated from dogs in Brazil.

Antimicrobial susceptibility of Clostridium perfringens isolated from piglets with or without diarrhea in Brazil

The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined for 13 antibiotics against Clostridium perfringens isolated from Brazilian piglets. The collection of isolates was performed in June to October 2010. All isolates were susceptible to amoxicillin and ceftiofur, whereas most were resistant to tetracycline and lincomycin. Avilamycin and narasin were more effective against isolates from non-diarrheic than from diarrheic piglets. The other antimicrobials were less active in need of high concentrations to inhibit the growth of the C. perfringens type A. These results suggest the need for further studies evaluating molecular factors related to the antimicrobial resistance of C. perfringens.

First confirmed case of Clostridium difficile-associated diarrhea in foals in Brazil / Primeiro relato de diarreia associada à Clostridium difficile em potros no Brasil

Despite of the substantial role of Clostridium difficile in causing diarrhea and colitis in foals, there have been no confirmed diagnoses of disease caused by this bacteria in Brazil. In this paper, we describe confirmed cases of colitis caused by C. difficile in two foals in Brazil. Two five-month-old foals with a five-day history of diarrhea after antibiotic treatment for a respiratory disease were treated at the Veterinary Hospital of the Universidade Federal de Minas Gerais. C. difficile A/B toxins were detected, and toxigenic strains of C. difficile were isolated from the foals' feces. The treatment was based on fluid therapy and antibiotics (metronidazole and ceftiofur), and the animals experienced a gradual recovery. The association between the medical history, clinical signs, laboratory exam results and therapeutic success confirmed the diagnosis of C. difficile-associated diarrhea. The present report raises the possibility that C. difficile is also a pathogen in equines in Brazil and highlights the need for up to date routine laboratory protocols for the diagnosis of this disease.

Apesar da importância de Clostridium difficile como agente causador de diarreia e colite em potros, inexistem relatos confirmados de tal doença no Brasil. O objetivo deste trabalho foi descrever dois casos confirmados de diarreia causados por C. difficile em potros, ocorridos em Minas Gerais, Brasil. Os animais, com cinco meses de idade, foram encaminhados ao Hospital Veterinário da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) com histórico de cinco dias de diarreia após antibioticoterapia com penicilina para uma possível pneumonia. Ambos os animais foram positivos para detecção das toxinas A/B de C. difficile e isolados toxigênicas de C. difficile foram isoladas de amostras de fezes. Os animais apresentaram melhora gradual com o tratamento baseado em metronidazol e fluidoterapia e receberam alta após sete dias. A associação do quadro clínico, exames laboratoriais e o sucesso terapêutico permitem confirmar o diagnóstico de colite por C. difficile. O presente trabalho chama a atenção para a possibilidade de diarreia causada por C. difficile em equinos no Brasil e reforça a necessidade do diagnóstico para tal infecção na rotina laboratorial.

Detection of enterotoxin A and cytotoxin B, and isolation of Clostridium difficile in piglets in Minas Gerais, Brazil / Detecção da enterotoxina A e citotoxina B e isolamento de Clostridium difficile em leitões em Minas Gerais, Brasil

Clostridium difficile has emerged as a major cause of neonatal colitis in piglets, displacing classic bacterial pathogens. However, there is no information regarding the distribution of this microorganism in pig farms in Brazil. In the present study, the presence of toxins A/B and of C. difficile strains in stool samples from 60 diarrheic or non-diarrheic newborn piglets (one to seven days old), from 15 different farms, was studied. The presence of toxins A/B was detected by ELISA and PCR was used to identify toxin A, toxin B and binary toxin gene in each isolated strain. C. difficile A/B toxins were detected in ten samples (16.7 percent). Of these, seven were from diarrheic and three were from non-diarrheic piglets. C. difficile was recovered from 12 out of 60 (20 percent) fecal samples. Of those, three strains were non-toxigenic (A-B-) and nine were toxigenic. Of the nine toxigenic strains, four were A+B+ strains and five were A-B+ strains. The presence of binary toxin observed in the present study was much higher (50 percent) than in previously reported studies. All three non-toxigenic strains were isolated from otherwise healthy piglets. The results suggest the occurrence of neonatal diarrhea by C. difficile in farms in Brazil.

Clostridium difficile tem sido relatado como o principal causador de colite neonatal em suínos. Apesar da crescente importância deste agente, não há dados sobre infecções causadas por C. difficile em suínos no Brasil. O objetivo do presente estudo foi detectar as toxinas A/B e isolar C. difficile a partir de 60 amostras de fezes de leitões diarreicos ou apararentemente saudáveis, com no máximo sete dias de vida, e oriundos de 15 granjas diferentes. As toxinas A/B foram detectadas por ELISA e uma PCR multiplex foi utilizada para detecção dos genes responsáveis pela codificação das toxinas A, B e toxina binária. As toxinas A/B de C. difficile foram detectadas em dez amostras de fezes (16.7 por cento). Dessas, sete eram de animais diarreicos e três de leitões aparentemente saudáveis. Foi possível isolar C. difficile em 12 das 60 (20 por cento) amostras trabalhadas. Dessas, três estirpes eram não-toxigênicas (A-B-) e nove eram toxigênicas, sendo quatro caracterizadas como A+B+ e cinco como A-B+. O gene responsável pela codificação da toxina binária foi encontrado em 50 por cento das estirpes isoladas, proporção superior ao relatado em estudos anteriores. Todas as estirpes não toxigênicas foram isoladas de animais não diarreicos. Os resultados encontrados sugerem a ocorrência de diarreia por C. difficile em granjas no Brasil.

Padronização da titulação da toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D em linhagem contínua de células como alternativa ao bioensaio animal / Standardization of the titration of the epsilon toxin of Clostridium perfringens type D in cell line as an alternative to animal bioassay

Enterotoxemia, também chamada de doença do rim pulposo, doença que acomete os ruminantes domésticos, é causada pela ação da toxina épsilon produzida pelo Clostridium perfringens tipo D, um anaeróbio comumente isolado do solo e das fezes de animais sadios. O método tradicional de diagnóstico baseia-se na detecção e classificação dessa exotoxina no conteúdo intestinal por meio da soroneutralização em camundongos. Com isso, o objetivo deste estudo foi padronizar um teste para detecção e titulação dessa toxina in vitro e compará-lo ao fenômeno in vivo. Para isso, uma partida de toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D foi titulada em camundongos e em várias linhagens contínuas de células. Após a determinação da linhagem celular mais sensível, realizaram-se ensaios de titulação in vitro de diluições de uma partida de toxina, comparando-os com os títulos in vivo conhecidos. Os resultados foram agrupados, e foi desenvolvida a equação matemática que melhor adaptou-se aos intervalos trabalhados. A linhagem MDCK, além de mais sensível, demonstrou que o fenômeno observado in vitro pode ser expresso por meio da equação matemática que apresenta uma correlação de 98,33 por cento, com a dose mínima mortal determinada in vivo. Portanto, a linhagem MDCK permite titular a toxina épsilon de C. perfringens tipo D de forma específica e sensível, além de ser uma técnica prática, rápida e que dispensa o uso de animais.

Enterotoxemia (also called pulpy kidney disease) is an enteric disease, that affect ruminants, produced by epsilon toxin from Clostridium perfringens type D, an anaerobic commonly isolated from soil and feces of healthy animals. The diagnostic is based on detection of this exotoxin in the intestinal content by soroneutralization in mice. Therefore, this study aimed to standardize a test for detection and titration of the toxin in vitro, and compare it with the phenomenon in vivo. A volume of epsilon toxin was titrated in mice and in some cell lines. After concluding the most sensitive cell line, were held in vitro titrations of dilutions from a toxin wich one had in vivo titer known. The results were grouped and a mathematical equation was developed. MDCK cell line showed that the phenomenon observed in vitro can be expressed by a mathematical equation wich shows a correlation of 98.33 percent with a minimum lethal dose determined in vivo. Therefore, the soroneutralization using MDCK allows a specific, sensitive, practical, fast, and doesn't requere use of animal titration of epsilon toxin.

Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra toxina épsilon de Clostridium perfringens Tipo D / Production and characterization of monoclonal antibodies against Clostridium perfringens Type D epsilon toxin

Clostridium perfringens tipo D é o agente etiológico da enterotoxemia em ruminantes, causada pela toxina épsilon e caracterizada por edema cardíaco, pulmonar, renal e cerebral. Anticorpos monoclonais contra toxina épsilon de C. perfringens tipo D foram produzidos a partir da fusão da linhagen de mieloma P3-X63-Ag8 653 com células do baço de camundongos Balb/c imunizados com o toxóide épsilon. Seis linhagens de híbridos secretores de anticorpos monoclonais das classes e IgM e IgG foram estabelecidas.

Clostridium perfringens type D is the aetiological agent of enterotoxemia in ruminants. The disease is caused by epsilon toxin characterized by cardiac, pulmonary, kidney and brain edema. Monoclonal antibodies were produced by using myeloma cell line P3-X63-Ag8 653 fused with spleen cells from Balb/c mice, immunized with epsilon toxoid of C. perfringens type D. Six hybrids were established secreting monoclonal antibodies of the IgM class and IgG3 subclass.

Botulismo em ruminantes causado pela ingestão de cama-de-frango / Botulism in ruminants being fed with poultry litter

Botulismo é uma intoxicação causada pela ingestão das toxinas produzidas pelo Clostridium botulinum, que acomete mamíferos e aves. Neste trabalho é descrito um surto de botulismo em ruminantes, ocorrido em duas propriedades localizadas no município de Patos, no Estado da Paraíba, Brasil. Em uma das propriedades, de um total de 88 bovinos, 85 (96,6 por cento) vieram a óbito. Na segunda, morreram 145 ovinos (96,7 por cento), 233 caprinos (57,8 por cento) e 30 bovinos (96,8 por cento). Os animais acometidos apresentavam paralisia progressiva, dificuldade de locomoção, sialorréia e dispnéia. A morte ocorreu entre 24 e 48 horas após o início dos sinais, por parada cardio-respiratória. Nenhuma alteração significativa foi observada no exame post-mortem. O diagnóstico de botulismo foi confirmado pela demonstração das toxinas C e D no conteúdo intestinal e na cama-de-frango utilizada na alimentação dos animais, pela técnica de soroneutralização em camundongos.

Botulism is a poisoning caused by the ingestion of toxins produced by Clostridium botulinum, that infects mammals and birds. This article reports an outbreak of botulism in two different flocks of ruminants at Paraíba, Brazil. In one, 85 out of 88 (96.6 percent) cattles died. In the other, 145 (96.7 percent) sheeps, 233 (57.8 percent) goats and 30 (96.8 percent) cattles died. Clinical signs were progressive paralysis, difficulties in moving, sialorrhoe and dyspnoe. Death occurred 24 to 48 hours after the beginning of clinic signs and at post-mortem examination no noteable changes were observed. Type C and D toxins were demonstrated in the intestinal contents and poultry litter by neutralization test in mice.